改良CTAB法提取DNA的原理主要基于CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)的特性。CTAB是一种阳离子去污剂,能够溶解细胞膜并与核酸形成复合物。在高离子强度的溶液中(>0.7mol/L NaCl),CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物,但不能沉淀核酸。通过有机溶剂抽提,去除蛋白、多糖、酚类等杂质后,加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。
具体步骤如下:
- 细胞裂解:通常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞,加入预热过的CTAB缓冲液进行细胞裂解。
- 蛋白酶消化:加入蛋白酶K消化蛋白质,去除DNA周围的蛋白质。
- 有机物提取:加入苯酚和氯仿等有机溶剂,能使蛋白质变性,并使抽提液分相,因核酸(DNA、RNA)水溶性很强,经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。
- 乙醇沉淀:上清液中加入异丙醇或乙醇使DNA沉淀,沉淀DNA溶于双蒸水或TE溶液中。
- 洗涤和干燥:对沉淀进行洗涤、干燥,重新溶解后得到DNA溶液。
改良CTAB法的优点在于其对大多数样品都适用,尤其是植物和真菌样品,这些样品中的DNA常常与大量的多糖和蛋白质混合。CTAB能有效去除这些杂质,而且操作过程相对简单,不需要昂贵的仪器。