在实时荧光定量PCR(qPCR)实验中,使用18S rRNA作为内参基因是一种常见的选择,因为它在大多数真核细胞中的表达相对稳定。为了降低空白对照的影响,可以采取以下几种策略:
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使用无模板对照(NTC):在反应体系中不加入任何模板,仅用于监控反应体系中的污染。如果NTC孔出现扩增,则说明体系中存在污染。
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优化实验操作:确保样本处理、RNA提取和逆转录等步骤的质量。任何步骤中的问题都可能导致空白对照的异常,因此需要严格按照标准操作流程(SOP)进行实验。
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设置阳性对照:使用含有扩增片段的质粒或基因组DNA作为阳性对照,以监控反应体系的正常性。
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使用多个内参基因:为了提高实验结果的可靠性,可以选择多个内参基因进行验证。如果多个内参基因的表达都相对稳定,那么实验结果的可信度就更高。
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控制扩增效率:确保内参基因和目的基因的扩增效率基本一致,以避免因扩增效率差异导致的实验误差。
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数据分析:在数据分析时,使用相对定量方法(如ΔΔCt法)来计算目标基因的表达变化,以校正实验误差。
通过以上方法,可以有效降低空白对照对实验结果的影响,提高qPCR实验的准确性和可靠性。