5'端

在PCR扩增中添加酶切位点时，应在引物的 5'端 添加相应的碱基序列。以下是具体说明：

一、添加位置原则

1. 方向性要求

   PCR扩增遵循5'→3'方向进行，因此酶切位点需添加在引物的5'端，而扩增产物则从3'端延伸。

2. 酶切位点匹配

   需根据目标载体或酶切工具的序列设计互补的酶切位点，并在引物5'端添加1-2个保护碱基（如NGG、TTT等）以防止非特异性结合。

二、注意事项

1. 避免3'端特殊序列

   • 3'端连续3个以上相同碱基（如GGG或CCC）可能增加错配风险；

   • 3'端A碱基易导致错配效率降低，建议避免使用。

2. 引物设计规范

   • GC含量 ：40%-60%为宜，过高易产生非特异条带；

   • 序列规则 ：避免5个以上嘌呤或嘧啶连续排列，可适当加入引物二聚体抑制剂；

   • 长度 ：通常为15-30个碱基，特殊需求可延长至50个以上。

3. 避免引物互补

   上游引物与下游引物需设计为非互补序列，否则可能形成引物二聚体，抑制扩增。

三、示例

若目标载体3'端有ATCG序列，需设计一对引物：

• 上游引物 ：5'-保护碱基（如NGG）+ATCG+引物序列-3'；

• 下游引物 ：5'-互补序列+引物序列-3'。

通过以上规范操作，可确保酶切位点准确定位并有效扩增目标基因。