以下是DNA粗提取与鉴定的完整实验步骤及原理说明:
一、材料准备
- 实验材料选择
优先选用DNA含量高的生物组织(如鸡血细胞或洋葱)。鸡血需提前与抗凝剂(如柠檬酸钠)混合防止凝固,离心后取细胞悬液。
二、细胞破碎与DNA释放
- 破碎细胞
加入等体积蒸馏水,沿同一方向快速搅拌5分钟,使细胞吸水涨破释放核物质。 - 初步过滤
用纱布过滤去除细胞膜碎片和大分子杂质,保留含DNA的滤液。
三、DNA溶解与杂质去除
- 溶解DNA
向滤液中加入2mol/L NaCl溶液40mL,沿同一方向搅拌至完全溶解,此时DNA溶解度高,部分蛋白质沉淀。 - 去除杂质
离心或静置后取上清液,去除沉淀的蛋白质。
四、DNA析出与纯化
- 改变浓度析出DNA
缓慢沿烧杯壁加入蒸馏水,降低NaCl浓度至0.14mol/L,DNA因溶解度最低形成白色絮状沉淀,而蛋白质仍溶解。 - 收集DNA沉淀
用纱布过滤或离心(1500r/min,5分钟)收集DNA黏稠物。 - 酒精纯化
加入等体积预冷的95%酒精,沿同一方向轻缓搅拌,DNA析出成丝状物,蛋白质溶解于酒精。离心后弃上清,保留沉淀。
五、DNA再溶解与鉴定
- 再溶解DNA
将沉淀溶于2mol/L NaCl溶液中备用。 - 二苯胺鉴定
取两支试管,分别加入5mL 2mol/L NaCl溶液(一支加DNA溶液,另一支为空白对照),再各加入4mL二苯胺试剂。沸水浴加热5分钟,含DNA的试管显蓝色。
关键原理总结
- 溶解性差异
DNA在2mol/L NaCl中溶解度高,0.14mol/L时析出,而蛋白质相反。 - 酒精沉淀
DNA不溶于冷酒精,可进一步去除脂质和蛋白质。 - 显色反应
DNA与二苯胺在沸水浴下生成蓝色化合物。
注意事项
- 使用塑料器皿减少DNA吸附损失。
- 搅拌方向需一致,避免DNA断裂。
- 酒精需预冷以提高DNA纯度。