ABL激酶区突变检测方法
ABL激酶区突变的检测通常涉及到一系列复杂的实验室程序，主要包括以下几个步骤：
- cDNA的制备：需要根据白细胞计数采集相应的标本量，以保证足量的有核细胞数。建议白细胞计数正常的患者，抽取4ml骨髓或8ml外周血标本。采用EDTA-Na2或枸橼酸钠抗凝标本。标本应尽量没有凝块，标本抽取后冷藏储存和运送，24h内进入处理步骤。建议采用裂解红细胞的方法获得有核细胞，RNA提取可以采用经典的TRIzol法或过柱法。高质量的cDNA样本是突变检测扩增的高成功率及突变结果的可重复性和准确性的保证，建议用于突变检测的样本ABL拷贝数10000。BCR-ABL融合基因检测阳性是实施ABL突变检测的前提。每份检测突变的样本应首先检测BCR-ABL和ABL的拷贝数，以判断标本质量以及是否能够检测突变。
- 扩增及测序：建议采用巢式PCR扩增以针对BCR-ABL检测突变并提高扩增测序的成功率。首先扩增BCR-ABL，再扩增BCR-ABL上的ABL。由于P210、P190及P230型BCR-ABL的上游引物不同，因此扩增前需明确患者BCR-ABL类型。PCR产物应覆盖目前已报道的有临床意义的突变，建议能够准确检测ABL上第230~490号氨基酸密码子。选用高保真及高扩增能力的DNA聚合酶。优化扩增条件使PCR特异产物多而非特异产物尽可能少。PCR产物建议采用切胶纯化法去除非特异条带。采用上下游引物分别进行双向测序。
- 结果分析：采用测序软件（如MutationSurveyor）或者相关网站上（如）不参比序列比对的方法确定读取的序列中突变点的存在及位置。仔细观察整个测序图谱各个位点的测序峰以防止漏掉低比例突变的突变点，正反向测序图谱相结合以减少漏检和提高准确性。如果突变峰很小难以判定时建议重复扩增检测。对于某个氨基酸位点发生一个以上碱基位点突变时可以根据目前已广泛报道的突变类型辅助判断，为得出明确结果需要进行克隆测序。注意特殊突变类型表现，如L248V型点突变，往往同时不缺失81个碱基的Δ（D248-274）突变体同时存在，由第248号氨基酸密码子中C突变为G后形成剪切位点造成，结果导致测序图谱从突变点开始表现为双峰，可以通过特征性的突变图谱判断（图1）或克隆测序确定。图1ABL基因L248V型点突变测序图谱关于缺失突变。BCR-ABL突变检测时常出现整个外显子7的缺失（图2），导致测序图谱从中段开始为双峰表现，目前这种类型的缺失突变临床意义不明，建议不报告。双峰影响微小突变的判断，建议从扩增步骤开始重新操作并测序，若重复后双峰情况依然存在，建议患者重新抽取标本检测，也可以通过克隆测序解决。图2ABL基因外显子7缺失突变测序图谱1个白血病克隆同时具有2种或2种以上突变类型称作复合突变，发生复合突变已证实具有临床意义。如果样本同时检测到2种或2种以上突变，建议进行克隆测序来确定是否是复合突变。
- 报告：检测报告中除了患者基本信息外，需包括①检测方法；②是否检测到突变，是否为复合突变（如检测到2种或2种以上突变，并经克隆测序确认）；③突变的氨基酸位点、氨基酸类型及碱基；④突变比例。突变比例具有一定的临床意义，因此最好包括到报告中，但是由于测序峰比例不完全代表样本中真实的突变比例，因此建议只报告大概的突变比例（如，大部分、小量、约80%等），无需精确的数值展示。对于因标本质量差或BCR-ABLmRNA水平低导致扩增及测序失败时，应如实报告而不能报告未检测到突变。
以上就是ABL激酶区突变检测的基本流程和注意事项。这些步骤确保了检测的准确性和可靠性，从而为临床治疗提供了重要的参考信息。
