有CD3/CD28抗体法、CD3/CD28磁珠法、CD3/CD28多聚体法三种方法。
CD3/CD28抗体法
- 抗体包被：用无菌PBS将anti-mouseCD3抗体（克隆号：145-2C11）稀释至5μg/ml，稀释后的抗体加入到24孔板中，每孔400μl，4°C包被过夜。
- 小鼠脾脏淋巴细胞分离：将70μm细胞筛网置于培养皿中，取小鼠脾脏放置于筛网中，加入5ml达优小鼠淋巴细胞分离液，对脾脏轻轻进行研磨。把悬有脾脏细胞的的分离液立即转移至15ml离心管中，随后在分离液上层轻轻覆盖500-1000μl的RPMI1640培养基。室温，水平转子800g离心30分钟，设置离心机为缓升缓降。离心结束后吸出淋巴细胞层（白膜层），加入10mlRPMI1640洗涤一遍细胞，250g离心10分钟收集细胞。将上一步离心得到的细胞沉淀，重悬至扩增培养基中，并进行计数。
- 细胞刺激：将细胞浓度调整至1-2×10^6/ml。从4°C冰箱取出前一天包被的板子，弃掉包被液，无菌PBS洗涤3遍。每孔加入500μl细胞悬液，放置于37°C含5%CO2细胞培养箱中培养。
CD3/CD28磁珠法
除直接使用功能学抗体以外，目前磁珠法（CD3/CD28抗体偶联磁珠）也是激活扩增T细胞比较常见的方法之一。
CD3/CD28多聚体法
- 实验原理：使用低亲和力的抗CD3和抗CD28的抗体Fab片段（非传统全长抗体），结合上Twin-Strep-tag亲和标签，形成CD3Fab-Strep和CD28Fab-Strep。再结合可溶性蛋白多聚体Strep-Tactin，在亲和力作用下，即可与TCR和CD28共刺激受体多价结合，来传递激活信号。
- 实验步骤：小鼠脾脏淋巴细胞的分离与上面抗体法中步骤相同。将CD3Fab-Strep、CD28Fab-Strep、Strep-Tactin Multimer按照1：1：1的比例进行混合，4°C孵育20分钟，期间进行连续搅拌。用培养基（成分：RPMI1640+10%血清+50U/ml IL-2）调整细胞浓度至5×10^5/ml，将步骤（1）中制备好的CD3/CD28Streptamer complexes与细胞悬液进行混合，轻轻吹匀后，将细胞加入到细胞培养板中，放置于37°C含5%CO2细胞培养箱中培养。
以上就是关于CD3/CD28刺激T细胞的几种常见方法。需要注意的是，在实际操作过程中，应严格遵守实验室安全规程，并根据具体实验条件和目的选择合适的方法。
