低温操作，避免震荡，多次洗涤

质粒DNA提取过程中需注意以下关键事项，以确保提取效率和DNA质量：

一、实验前准备

1. 试剂与仪器

   • 使用高纯度裂解缓冲液（含葡萄糖、EDTA等）；

   • 选择合适离心机，转速通常为12000 rpm；

   • 准备冰浴设备以保持低温。

2. 菌体处理

   • 菌体需均匀悬浮，避免结块；

   • 接种后及时收获，避免长时间培养导致质粒降解。

二、核心操作要点

1. 裂解步骤

   • 加入溶液I（含NaOH、SDS）后，轻柔颠倒离心管5次，避免剧烈震荡；

   • 冰浴5分钟以减少DNA变性。

2. 质粒分离

   • 加入溶液II（酸化缓冲液）后，同样轻柔颠倒离心管5次，直至溶液变透明粘稠；

   • 冰浴5分钟促进沉淀形成。

3. 纯化与洗涤

   • 用酚-氯仿-异戊醇混合液进行三次抽提，分离DNA与蛋白质、杂质；

   • 洗涤时使用70%乙醇，避免过度洗涤导致DNA损失。

4. 质粒洗脱与溶解

   • 用低盐洗脱液（如TE缓冲液）收集质粒DNA；

   • 最后用去离子水或TE缓冲液溶解沉淀，检查DNA浓度与完整性。

三、关键注意事项

1. 低温控制

   • 整个提取过程需在4℃或冰浴条件下进行，避免高温导致DNA降解。

2. 避免蛋白污染

   • 使用酚/氯仿抽提时动作轻柔，避免剧烈震荡；

   • 洗涤步骤需彻底，防止残留蛋白质影响后续酶切反应。

3. 管口处理

   • 离心后及时倒扣离心管，避免上清液残留代谢物或细胞碎片。

4. 试剂配制

   • 溶液II需现配现用，避免失效；

   • EDTA浓度控制在10 mM，防止金属离子对DNA的降解。

四、质量检测

1. 凝胶电泳

   • 通过电泳分析DNA大小与浓度，确认无降解或污染；

   • 对比标准品（如质粒载体）验证纯度。

2. 浓度优化

   • 可适当提高AMP浓度（如200 μg/ml）以增加质粒丰度。

通过严格遵循上述步骤和注意事项，可高效提取高纯度质粒DNA，为后续实验奠定基础。